賽默飛Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑（貨號(hào)11668019）說明書及操作指南

一、產(chǎn)品概述

Lipofectamine 2000是賽默飛世爾研發(fā)的高效陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的DNA、siRNA及CRISPR組件遞送。其采用脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)，在保證轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)顯著降低細(xì)胞毒性，被廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)調(diào)控、RNA干擾及基因編輯研究。

二、核心參數(shù)

· 貨號(hào)：11668019

· 包裝規(guī)格：0.75 mL / 1.5 mL

· 適配樣本：DNA（質(zhì)粒、PCR產(chǎn)物）、RNA（siRNA/miRNA/lncRNA）

· 推薦細(xì)胞類型：HEK293、HeLa、CHO、原代細(xì)胞等

· 儲(chǔ)存條件：4℃避光保存（嚴(yán)禁凍存）

· 有效期：未開封12個(gè)月，開封后6個(gè)月

三、標(biāo)準(zhǔn)操作流程（以6孔板為例）

1. 試劑配制

①稀釋液選擇：Opti-MEM®（貨號(hào)31985070）或同類型無血清培養(yǎng)基

②DNA稀釋：每孔2-4 μg DNA，用250 μL稀釋液混勻

③脂質(zhì)體稀釋：按DNA用量1:2.5比例稀釋（如2 μg DNA需5 μL Lipofectamine 2000）

2. 復(fù)合物制備

①將DNA與脂質(zhì)體稀釋液等體積混合

②室溫靜置15-20分鐘，形成乳白色復(fù)合物（顯微鏡下可見均勻納米顆粒）

3. 細(xì)胞處理

①轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞密度：70%-80%融合

②移除原培養(yǎng)基，加入1 mL含復(fù)合物的新鮮培養(yǎng)基

③37℃培養(yǎng)4-6小時(shí)后換液

四、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

1. 細(xì)胞狀態(tài)要求

優(yōu)先選用低傳代細(xì)胞（P5-P10），原代細(xì)胞建議預(yù)鋪ECM基質(zhì)（如Matrigel®）

2. 血清干擾機(jī)制

DNA轉(zhuǎn)染可保留≤10%血清，RNA轉(zhuǎn)染需全程無血清（避免核酸酶降解）

3. 毒性控制

①貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染時(shí)間≤6小時(shí)（超時(shí)存活率下降20%-30%）

②懸浮細(xì)胞建議采用分步換液法

五、跨場(chǎng)景應(yīng)用案例

1. CRISPR/Cas9基因編輯體系構(gòu)建

質(zhì)粒配比：Cas9質(zhì)粒（1 μg）: sgRNA（1.5 μg）

共轉(zhuǎn)染支持：可同步遞送熒光報(bào)告質(zhì)粒（如pmCherry-C1）

效率驗(yàn)證：轉(zhuǎn)染48小時(shí)后Western Blot檢測(cè)靶蛋白敲除效果（編輯效率≥80%）

2. siRNA沉默實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

siRNA工作濃度：20-50 nM

復(fù)合物靜置時(shí)間：嚴(yán)格控制在20分鐘內(nèi)（超時(shí)導(dǎo)致效率衰減≥15%）

結(jié)果檢測(cè)：qPCR驗(yàn)證mRNA水平（建議設(shè)置GAPDH內(nèi)參對(duì)照）

六、技術(shù)問題排查指南

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