PCR引物是人工合成的一段寡聚核苷酸。PCR中通常需要兩種引物。一種與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)， 另—種與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。PCR產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補(bǔ)的程度。引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵，因此，PCR的首要任務(wù)就是引物設(shè)計(jì)。引物設(shè)計(jì)的好壞，直接影響了PCR的結(jié)果。成功的PCR反應(yīng)既要高效，又要特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。那么PCR引物設(shè)計(jì)的原則有哪些呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

引物設(shè)計(jì)的目的是在兩個(gè)目標(biāo)之間取得平衡：擴(kuò)增特異性和效率。因此，引物的設(shè)計(jì)需要遵循以下原則

一、引物長(zhǎng)度要適宜

一般，引物的長(zhǎng)度為15-23bp，常用的長(zhǎng)度為18-21bp。過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq 酶進(jìn)行反應(yīng)。過(guò)短則特異性差。

二、引物GC含量要適宜

1.引物3'端的堿基一般不用A，因?yàn)?/span>A在錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對(duì)比較高， 而其它三種堿基的錯(cuò)誤引發(fā)效率相對(duì)小一些。

2.3'端防止連續(xù)三個(gè)C或G，引物的GC含量一般為45-55%，過(guò)高或過(guò)低都不利于引發(fā)反應(yīng)。

3.上下游引物的GC含量不能相差太大。

三、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列

堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，從而影響引物與模板的復(fù)性結(jié)合。

四、引物5'端可以修飾，3'端不可修飾

1引物的5' 端決定著PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，它對(duì)擴(kuò)增特異性影響不大。因此，可以被修飾而不影響擴(kuò)增的特異性。引物5'端修飾包括：加酶切位點(diǎn)，加標(biāo)記熒光，引入點(diǎn)突變、插入突變、缺失突變序列；引入啟動(dòng)子序列等。

2引物的延伸是從3'端開始的，不能進(jìn)行任何修飾。

3在引物的5`端連接一對(duì)限制酶的識(shí)別序列，這樣便于目的基因連接到載體上。

五、退火溫度要適宜

退火溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)；退火溫度低，擴(kuò)增效率高。

原因：如果引物堿基數(shù)較少，可以適當(dāng)提高退火溫度，這樣可以使PCR的特異性增加；如果堿基數(shù)較多，那么可以適當(dāng)減低退火溫度，使DNA雙鏈結(jié)合。一對(duì)引物的退火溫度相差4℃～6℃不會(huì)影響PCR的產(chǎn)率，但是理想情況下一對(duì)引物的退火溫度是一樣的。

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